环境科学研究  2017, Vol. 30 Issue (8): 1287-1294  DOI: 10.13198/j.issn.1001-6929.2017.02.41

引用本文  

樊晓燕, 高景峰, 王时杰, 等. 同步脱氮除磷系统中两种颜色好氧颗粒污泥的微生物群落特征[J]. 环境科学研究, 2017, 30(8): 1287-1294.
FAN Xiaoyan, GAO Jingfeng, WANG Shijie, et al. White and Yellow Aerobic Granular Sludge Microbial Structures Appearing in a Simultaneous Nitrogen and Phosphorus Removal System Using High-Throughput Sequencing[J]. Research of Environmental Sciences, 2017, 30(8): 1287-1294.

基金项目

国家自然科学基金项目(51378027,51578015);北京市自然科学基金项目(8162010)

责任作者

高景峰(1974-), 男, 黑龙江海伦人, 教授, 博士, 博导, 主要从事水污染控制研究, gao.jingfeng@bjut.edu.cn

作者简介

樊晓燕(1988-), 女, 河南三门峡人, fanxiaoyan0229@163.com

文章历史

收稿日期:2017-01-20
修订日期:2017-04-20
同步脱氮除磷系统中两种颜色好氧颗粒污泥的微生物群落特征
樊晓燕1 , 高景峰1 , 王时杰1 , 张丽芳1 , 张树军2 , 高永青2 , 张帅2     
1. 城镇污水深度处理与资源化利用技术国家工程实验室, 北京工业大学环境与能源工程学院, 北京 100124;
2. 北京城市排水集团有限责任公司科技研发中心, 北京 100124
摘要:为研究同步脱氮除磷系统中出现的WG(白色好氧颗粒污泥)外形特点及微生物群落特征,探究其成因,利用SEM(扫描电子显微镜)表征了系统中的WG与YG(黄色好氧颗粒污泥)的微观形态,并采用Illumina HiSeq 2500高通量测序平台对两种好氧颗粒污泥中细菌与真菌的群落组成进行研究.结果表明:WG结构疏松外形不规则,颗粒表面分布大量杆菌;而YG饱满紧实轮廓清晰,颗粒表面分布大量球菌.WG与YG的细菌群落组成相似,但真菌组成差异较大.与YG相比,WG具有更高的细菌和真菌多样性.变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为WG和YG中的细菌优势门,其在WG中的相对丰度分别为68.85%和26.61%,在YG中的相对丰度分别为82.52%和12.30%.Candidatus competibacter、Candidatus accumulibacterChiayiivirga为WG中的优势属,相对丰度分别为22.13%、8.95%和7.37%;Candidatus competibacter、ChiayiivirgaXanthomonas为YG中的优势属,相对丰度分别为47.94%、6.95%和7.06%.子囊菌门(Ascomycota)和Rozellomycota分别为WG与YG中真菌优势门,其在两个样品中的相对丰度分别为50.10%和81.77%.在属水平,WG中存在大量青霉属(Penicillium)和假丝酵母属(Candida)等丝状真菌,为WG的形成提供了框架.研究显示,当YG破碎成为小菌胶团后,附着在真菌框架上,造成了WG的快速形成,同时WG中Candidatus competibacter的相对丰度较低,使其外形疏松、透光性较好,呈现出白色.
关键词白色好氧颗粒污泥    黄色好氧颗粒污泥    高通量测序    细菌群落组成    真菌群落组成    
White and Yellow Aerobic Granular Sludge Microbial Structures Appearing in a Simultaneous Nitrogen and Phosphorus Removal System Using High-Throughput Sequencing
FAN Xiaoyan1 , GAO Jingfeng1 , WANG Shijie1 , ZHANG Lifang1 , ZHANG Shujun2 , GAO Yongqing2 , ZHANG Shuai2     
1. National Engineering Laboratory for Advanced Municipal Wastewater Treatment and Reuse Technology, Beijing University of Technology College Environmental and Energy Engineering, Beijing 100124, China;
2. Beijing Drainage Group Co. Ltd Technology R & D Center, Beijing 100124, China
Abstract: In a simultaneous nitrogen and phosphorus removal system, both white and yellow aerobic granular sludge (WG and YG) appeared. Scanning electron microscopy (SEM) was used to observe the micro-morphology of WG and YG. Illumina HiSeq 2500 platform was applied to investigate their bacterial and fungal communities, and to explore the reasons for the formation of WG. WG was loose and irregular, while YG was compact and regular. The results of SEM indicated that bacillus and coccus were dominant on the surface of WG and YG, respectively. The bacterial community of WG and YG was similar, while their fungal community was significantly different. The α-diversity of WG was higher than that of YG. Proteobacteria and Bacteroidetes were the dominant phyla in WG and YG. Their relative abundances in WG were 68.85% and 26.61%, respectively. For YG, their relative abundances were 82.52% and 12.30%, respectively. Candidatus competibacter(22.13%), Candidatus accumulibacter (8.95%) and Chiayiivirga (7.37%) dominated in WG. Candidatus competibacter(47.94%), Chiayiivirga (6.95%) and Xanthomonas (7.06%) were the dominant genera in YG. Ascomycota and Rozellomycota were the main fungal phyla in WG and YG, with relative abundances of 50.10% and 81.77%, respectively. Penicillium and Candida were the dominant filamentous fungi in WG. When YG disintegrated into small zoogloea, it attached to the framework of filamentous fungi and grew rapidly, which might be a reason for the formation of WG. The low relative abundance of Candidatus competibacter might be a reason for the loose shape of WG.
Keywords: white aerobic granular sludge    yellow aerobic granular sludge    high-throughput sequencing    bacterial community composition    fungal community composition    

自20世纪90年代被首次报道以来,好氧颗粒污泥工艺一直被认为是一种高效、前景广阔的处理工艺[1]. 2005年,荷兰代尔伏特理工大学与DHV公司率先推出了以好氧颗粒污泥中试为基础的Nereda® 工艺.自2008年第一座采用Nereda® 工艺的市政污水处理厂——南非Gansbaai污水处理厂投入运行以来,全球已有30多座采用该工艺的污水厂投入运行或建设.

与普通的活性污泥相比,好氧颗粒污泥具有污泥密度大、生物量高、沉降性能好、抗冲击负荷等优点,因其结构对溶解氧的传质限制,从而有利于在单污泥系统中实现SNPR(simultaneous nitrogen and phosphorus removal,同步脱氮除磷)[2].利用好氧颗粒污泥实现SNPR一直是研究热点. WEI等[3-5]对SNPR中N/P的去除效果、机理以及脱氮除磷相关微生物进行了研究.同时,分子生物学方法也被应用于研究好氧颗粒污泥微生物群落结构. Weissbrodt等[6]应用T-RFLP技术研究了污泥好氧颗粒化过程中微生物群落结构的变化. WANG等[7]应用PCR-DGGE技术研究了好氧颗粒污泥启动阶段氨氧化微生物的群落结构.但是,这些传统的分子生物学方法由于PCR偏差和通量低等特点,存在一定限制.

随着高通量测序技术的出现,由于其具有通量高、周期短、价格低等优点,其在环境微生物研究领域得到了广泛的应用.同时,高通量测序技术也被应用于颗粒污泥的研究中. HE等[8-9]利用高通量测序技术研究了污泥好氧颗粒化过程中微生物群落结构的变化,分析了特定微生物与污泥颗粒化的关系.在以往的研究中,基于不同水质、不同底物浓度和不同运行方式进行好氧颗粒污泥的培养,虽然得到的好氧颗粒污泥颜色各异,但同一反应器中的好氧颗粒污泥颜色较为统一[6-9].而在该研究中,已培养出YG(yellow aerobic granular sludge,黄色好氧颗粒污泥)的反应器中,阶段性出现了一种WG(white aerobic granular sludge,白色好氧颗粒污泥),二者形态差别明显,WG的出现未对系统的SNPR效果产生影响,这种现象在之前的研究中鲜有报道.因此,该研究以WG与YG为研究对象,利用SEM (scanning electronic microscopy,扫描电子显微镜)和Illumina HiSeq高通量测序技术,对二者的微观形态特点和细菌与真菌群落组成进行了研究,并从微生态的角度探讨了WG的形成机理,以期为好氧颗粒污泥反应器的应用提供理论基础.

1 材料与方法 1.1 试验装置

SBR材质为有机玻璃,总体积为85 L,直径30 cm,高120 cm,有效容积65 L,排水比为1/2(见图 1).反应器底部设曝气盘,采用空气压缩机供气,由气体流量计控制曝气量.反应器运行各阶段由时控开关控制,每个周期分为进水(10 min)、厌氧搅拌(60 min)、曝气(180 min)、沉淀、排水(10 min)、闲置6个阶段.其中沉淀时间由最初的15 min逐渐缩减至5 min,闲置时间随每天运行的周期数而改变.外加碳源由蠕动泵加入到反应器中.反应器设保温加热装置,控制温度在20~25 ℃.

注:1—原水箱;2—进水泵;3—止回阀;4—空气压缩机;5—气体流量计;6—曝气盘;7—外加碳源水箱;8—蠕动泵;9—液位计;10—电动搅拌器;11—加热装置;12—电动阀;13—时控开关;14—SBR. 图 1 SBR装置 Figure 1 The schematic diagram of SBR
1.2 接种污泥和试验用水

接种污泥取自北京市吴家村再生水厂,试验用水为生活污水,ρ(CODCr)、ρ(TN)、ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(PO43--P)分别为102.3~ 160.1、37.5~52.2、30.2~45.3、0.1~0.3、0.1~ 2.4、2.5~6.8 mg/L.由于所用生活污水ρ(CODCr)较低,因此,在进水中投加碳源,使进水ρ(CODCr)维持在400 mg/L左右.外加碳源由乙酸钠与丙酸钠混合配置而成.此外,在进水中补充氮与磷,使进水中ρ(NH4+-N)与ρ(PO43--P)分别维持在60和8 mg/L左右.

1.3 试验样品

采用逐步缩短沉淀时间的方法培养好氧颗粒污泥,反应器在运行40 d后形成好氧颗粒污泥,污泥粒径由种泥的124.0 μm(D50,下同)增至283.5 μm,运行130 d后达到764.2 μm.系统运行到第270天时,反应器内出现大量WG,与原有YG混合存在3~4周后逐渐消失.在此期间,系统TN和PO43--P的去除率保持稳定,分别在65%与95%以上,好氧颗粒污泥沉降性能未受影响.为了研究系统中WG的出现原因,以及WG与YG的微生物群落特性,取第270天时的污泥样品进行后续研究分析.

1.4 分析项目及方法

常规分析项目ρ(CODCr)、ρ(TN)、ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(PO43--P)等均采用国家标准方法[10]测定. ρ(DO)、pH采用WTW Multi 3400(WTW Laborprodukte,GER)便携分析仪测定. WG与YG的表面形态采用Olympus BX51/52(OLYMPUS,JPN)光学显微镜观察,微观形态使用Hitachi S-3400N(HITACHI,JPN)扫描电子显微镜表征.好氧颗粒污泥粒径分布使用Microtrac S3500(Microtrac Inc,USA)激光粒度分析仪测定.

1.5 DNA提取与高通量测序分析

挑选出样品中WG与YG,经过真空冻干后碾碎提取DNA.使用Fast DNA® Spin kit for soil(Qiagen,CA,USA)DNA试剂盒提取样品DNA,采用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA)测定提取DNA的浓度和质量. DNA样品送往北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序,测序平台为Illumina HiSeq 2500.测序内容为细菌16S rRNA Ⅴ4区,引物为515F(5′-GTGCCAGCMGC CGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3′),真菌为ITS区,引物为ITS5-1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2-2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′).原始测序数据经过筛选去除低质量序列和嵌合体后,得到有效的序列.为保证不同样品在相同的测序深度下进行比较,对序列进行均一化处理.之后,使用QIIME[11]进行后续分析.采用RDP分类方法划分OTUs(操作分类单元),相似度设置为97%.细菌OTUs的物种注释采用Silva数据库,真菌OTUs的物种注释采用Unite数据库,得到对应的物种信息后进行多样性及微生物群落结构分析.

2 结果与讨论 2.1 WG与YG外观形态

图 2(a)为WG与YG相机拍摄图.从图 2(a)可见,WG形态松散,边缘不规则,而YG形态较为规则、饱满. 图 2(b)(c)为WG与YG的显微镜拍摄图,WG〔见图 2(b)〕不够紧实,容易破碎;而YG〔见图 2(c)〕边界清晰且饱满紧实.

图 2 WG与YG泥外观形态 Figure 2 Morphology of WG and YG

由WG与YG的SEM图(见图 3)可见,WG经脱水处理后呈扁平状,表面存在大量褶皱,说明其内部结构疏松.进一步放大观察,可以发现WG表面存在大量杆菌〔见图 3(d)〕,其分布较为松散.YG外部轮廓更加清晰〔见图 3(e)〕,表面存在明显的凹陷与空隙,放大后,可以观察到颗粒表面分布着大量球菌〔见图 3(h)〕,这些球菌被一层粘稠状物质所覆盖粘连,这种黏稠状物质可能为细菌代谢产生的EPS(extracellular polymeric substances,胞外聚合物),其有利于微生物的凝聚并形成坚实的好氧颗粒污泥[12].综上,WG与YG在表面及微观形态上都存在较大区别,WG结构松散,而YG饱满紧实.

注:(a)~(d)为WG;(e)~(h)为YG. 图 3 好氧颗粒污泥SEM照片 Figure 3 SEM of aerobic granular sludge
2.2 WG与YG细菌群落差异 2.2.1 细菌多样性差异

WG与YG进行细菌16S rRNA V4区高通量测序后共产生118 401条有效序列,经均一化后,每个样品的有效序列数为49 020条.在97%的相似度下,WG与YG共得到1 028个OTUs.样品稀缺性曲线如图 4(a)所示,两条曲线都趋于平坦,表明测序结果涵盖了样品中绝大多数微生物信息.其中,WG的OTUs数为948,YG的OTUs数为878,可以看出WG中的微生物种类较多. 图 4(b)为Venn图,其中WG与YG共有的OTUs数为798,比例高达77.63%,表明WG在细菌群落组成上与YG存在较大的相似性,WG独有的OTUs占总数的14.59%,要略大于YG的7.78%.

图 4 细菌群落稀缺性曲线和Venn图 Figure 4 Rarefaction curve and venn diagram of bacterial community

表 1为WG和YG的α多样性指数表. Chao1丰富度指数与Shannon-Wiener、Simpson多样性指数可反映出样品中微生物的丰富度与多样性. WG的Chao1指数为1 070.825,大于YG的1 012.459,说明WG中细菌种类更加丰富. WG的Shannon-Wiener、Simpson多样性指数分别为6.427和0.962,大于YG的5.124和0.890,说明WG中微生物多样性较高.

表 1 细菌群落α多样性指数 Table 1 α-diversity indices of bacterial community
2.2.2 细菌群落组成差异

对样品OTUs代表序列进行物种注释,并将样品的有效序列划分到不同的分类水平(从门到属).该研究共得到22门、56纲、102目、204科和358属.两种好氧颗粒污泥中相对丰度>1%的门如图 5(a)所示.变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及放线菌门(Actinobacteria)为两样品的优势门,其在WG中的相对丰度为68.85%、26.61%和3.62%;在YG中为82.52%、12.30%和1.62%.从门水平上看出,WG中的优势门与YG相同,在相对丰度上差异较小.

图 5 WG和YG上细菌群落的分布 Figure 5 Distribution of bacterial community of WG and YG

在属水平,进一步筛选相对丰度大于1%的属(主要属)进行分析,结果见图 5(b).在WG和YG中分别发现了17和11个主要属,其总的相对分度分别为82.30%和74.65%.其中,Candidatus competibacter 是WG和YG中最为优势的属,其在两个样品中的相对丰度分别为22.13%和47.94%.此外,Candidatus accumulibacterChiayiivirga 为WG中的第二大和第三大主要属,其相对丰度分别为8.95%和7.37%. Chiayiivirga和黄杆菌属( Xanthomonas )为YG中的主要属,相对丰度分别为6.95%和7.06%.在WG和YG中都有各自相对丰度较高的属.噬细胞菌属(Cytophaga )、Candidatus accumulibacter、ChryseolineaIdeonella等属的相对丰度在WG中较高,而Candidatus competibacter 、黄杆菌属(Xanthomonas)、Dokdonella和潜蚤属(Dermatophilus)在YG中的相对丰度较高.此外,WG中属的分布与YG存在相似性,YG中相对丰度较高的属,同样存在于WG中,且含量较高,如Candidatus competibacterXanthomonasChiayiivirga等属,WG中也不存在独有且相对丰度较高的属,表明WG可能由破碎的YG生长形成.

2.3 WG与YG真菌群落差异 2.3.1 真菌多样性差异

WG与YG真菌ITS区高通量测序共产生78 973条有效序列,经均一化处理后,每个样品的有效序列数为24 528条.在97%的相似度下,共得到618个OTUs,其中WG中有551个,YG中有287个.样品稀释性曲线如图 6(a)所示,其中两条曲线最终都趋于平坦,说明测序结果能够覆盖大部分的真菌多样性.利用QIIME分析两样品OTUs的α多样性,结果如表 2所示. WG的Chao1指数为599.725,远大于YG的343.231,Shannon-Wiener和Simpson多样性指数(5.390和0.913) 也明显大于YG(1.874和0.396),说明WG中真菌多样性远高于YG. 图 6(b)为真菌OTUs的Venn图.两种好氧颗粒污泥共享的OTUs占总数的35.60%,WG单独拥有的OTUs占总数的53.56%,远大于YG的10.84%,说明WG与YG在真菌群落结构上存在较为明显的差别.

图 6 真菌群落稀缺性曲线和Venn图 Figure 6 Rarefaction curve and venn diagram of fungal community

表 2 真菌群落α多样性指数 Table 2 α-diversity indices of fungal community
2.3.2 真菌群落组成差异

真菌门水平分布如图 7(a)所示.两种好氧颗粒污泥中共存在11个门,WG中子囊菌门(Ascomycota)、Rozellomycota和壶菌门(Chytridiomycota)的相对丰度较高,分别为50.10%、25.93%和6.01%;YG中Rozellomycota和子囊菌门(Ascomycota)的相对丰度较高,分别为81.77%和6.95%.从门水平上看,WG与YG在真菌群落结构上存在较大差异,相比于YG,WG中子囊菌门的相对丰度较高,子囊菌门是真菌中最大的类群,其物种广泛分布在陆地和水环境中[13],表明WG的特殊形态可能与进水中所携带的真菌有关.而YG中优势门(Rozellomycota)单一且相对丰度较高,其在WG中也大量存在,证明WG可能是由破碎的YG生长形成.

图 7 WG和YG上真菌群落的分布 Figure 7 Distribution of fungal community of WG and YG

进一步对WG与YG中子囊菌门(Ascomycota)的真菌群落在目水平上的构成进行分析,结果如图 7(b)所示.经对比后发现,WG中格孢腔目(Pleosporales)、散囊菌目(Eurotiales)和酵母目(Saccharomycetales)真菌的相对丰度(20.10%、11.32%和10.31%)远高于YG(5.30%、0.93%和0.07%).格孢腔目(Pleosporales)真菌外形多为杆状或丝状[14].散囊菌目(Eurotiales)下的青霉属(Penicillium)真菌,以及酵母目(Saccharomycetales)下的假丝酵母属(Candida)真菌都具有丝状结构.青霉属(Penicillium)和假丝酵母属(Candida)在WG中的相对丰度分别为10.53%和8.68%,在YG中的相对丰度分别为0.79%和0.04%.这些丝状或杆状真菌在WG中的相对丰度很高,可能有利于WG的形成.

2.4 WG形成机理探究

Beun等[15]在研究污泥好氧颗粒化过程中提出了真菌假说,认为真菌菌丝在水力剪切作用下相互缠绕并起到框架作用,其有利于细菌附着生长形成好氧颗粒污泥. WG与YG在真菌群落组成上存在较大差异,子囊菌门(Ascomycota)在WG(50.10%)中的相对丰度远高于YG(6.95%),其中格孢腔目(Pleosporales)以及青霉属(Penicillium)和假丝酵母属(Candida)都具有丝状结构,并且在WG中的含量较高,说明丝状真菌可能相互缠绕形成了框架,有助于形成WG.而在YG中,相对丰度最高的为Rozellomycota(81.77%)门真菌;根据目前的研究,Rozellomycota门下发现的真菌多以寄生的方式存在于水霉或变形虫细胞核内,并不具有丝状结构[16-17],说明YG中可能不具有丝状真菌构成的框架. WG与YG的细菌群落组成存在相似性,变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)均为两样品的优势门,并且相对丰度相差较小,说明WG的形成与YG存在一定关系.该研究中WG出现在好氧颗粒污泥系统的成熟阶段,因此,可能由于系统中YG破碎形成小菌胶团后,这些小菌胶团附着在丝状真菌缠绕形成的框架上,快速生长形成了WG.

Yilmaz等[18-20]研究表明,在具有脱氮除磷功能的好氧颗粒污泥反应器中,厌氧/好氧交替的运行条件,以及丙酸盐作为碳源时,都有利于Candidatus competibacter的快速生长和富集.并且有研究指出,Candidatus competibacter可能会分泌胞外多糖形成EPS,有助于微生物团聚形成紧实的好氧颗粒污泥[21]. HUANG等[22-23]将好氧颗粒污泥切片,并采用SEM观测发现,好氧颗粒污泥中大多数细菌都分布在边缘部位,而核心部位主要由无机沉淀构成. Meyer等[24]采用荧光原位杂交等手段发现,在富集Candidatus competibacter 的好氧颗粒污泥中,其主要集中分布于好氧颗粒污泥表层,而核心部位活性微生物较少.该研究采用厌氧/好氧交替运行方式培养好氧颗粒污泥,并且外加碳源中含有丙酸钠,通过高通量测序发现,YG中富集有大量的Candidatus competibacter,其相对丰度为47.94%,可能造成YG团聚地更加紧实且内部活性微生物较少,这些原因可能导致YG透光性较差,呈现出棕黄色.而WG由于形成时间较短,Candidatus competibacter 在其中的相对丰度远低于WG,并且其内部可能为丝状真菌构成的骨架,因此形态更为疏松,可能使WG具有更好的透光性,因此呈现出白色;同时疏松的形态会使微生物与污水中底物和氧的接触更加充分,也可能使WG中微生物多样性更加丰富.

该研究中出现的WG在3~4周后逐渐消失,可能由于其结构松散,在曝气或搅拌过程中破碎,或逐渐生长转变成了YG. Barr等[25]在培养除磷好氧颗粒污泥的初期,反应器中也出现了WG与YG混合存在的现象,之后随着系统中污泥混合、破碎、生长,WG最终消失.

3 结论

a) 从外形上看,WG形态不规则,结构疏松容易破碎,脱水后,颗粒表面存在大量褶皱并分布有大量杆菌. YG轮廓清晰,饱满紧实,颗粒表面分布有大量球菌.

b) WG与YG在细菌群落结构上存在一定相似性,变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为WG和YG中的细菌优势门,其在WG中的相对丰度分别为68.85%和26.61%,在YG中的相对丰度分别为82.52%和12.30%. Candidatus competibacterCandidatus accumulibacterChiayiivirga为WG中的优势属,相对丰度分别为22.13%、8.95%、7.37%;Candidatus competibacterChiayiivirgaXanthomonas 为YG中的优势属,相对丰度分别为47.94%、6.95%、7.06%.子囊菌门(Ascomycota)和Rozellomycota分别为WG与YG中真菌优势门,其在两个样品中的相对丰度分别为50.10%和81.77%.

c) WG可能由破碎的YG生长形成,当其破碎形成小菌胶团后,这些小菌胶团附着在青霉属(Penicillium)和假丝酵母属(Candida)等丝状真菌组成的框架上,快速生长形成了WG.相较于YG,WG中Candidatus competibacter含量较低,并且存在大量丝状真菌,使其外形疏松、透光性较好,呈现出白色.

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