环境科学研究  2018, Vol. 31 Issue (8): 1457-1463  DOI: 10.13198/j.issn.1001-6929.2018.04.17

引用本文  

王秀红, 李欣欣, 史向远, 等. 好氧堆肥微生物代谢多样性及其细菌群落结构[J]. 环境科学研究, 2018, 31(8): 1457-1463.
WANG Xiuhong, LI Xinxin, SHI Xiangyuan, et al. Microbial Metabolism Diversity and Bacterial Flora Structure during Aerobic Composting[J]. Research of Environmental Sciences, 2018, 31(8): 1457-1463.

基金项目

山西省科技攻关项目(No.20150313003-5);山西省农业科学院科研项目(No.yydzx03,YCX2017D2106)
Key Science and Technology Program of Shanxi Province of China (No. 20150313003-5); Project of Shanxi Academy of Agricultural Sciences of China (No. yydzx03, YCX2017D2106)

责任作者

籍增顺(1963-), 男, 山西洪洞人, 研究员, 博士, 主要从事设施循环农业的理论和技术研究, jzs0308@163.com.

作者简介

王秀红(1975-), 女, 山西汾西人, 副研究员, 博士, 主要从事农业废弃物好氧堆肥研究, wxhsxy75@163.com

文章历史

收稿日期:2018-01-26
修订日期:2018-04-27
好氧堆肥微生物代谢多样性及其细菌群落结构
王秀红 , 李欣欣 , 史向远 , 王保平 , 周静 , 籍增顺     
山西省农业科学院现代农业研究中心, 山西 太原 030031
摘要:好氧堆肥是农业废弃物无害化处理和资源化利用的一条有效途径.为了探究好氧堆肥过程中微生物群落的代谢特征和细菌群落演替现象,了解起关键作用的微生物菌群,通过筛选强降解菌种改善堆肥工艺、提高堆肥效率,采用Biolog法和宏基因组法分析了玉米秸秆和牛粪联合好氧堆肥过程中微生物的碳源代谢能力和细菌群落多样性.结果表明:在第2次翻堆(第14天)时,微生物利用碳源的能力最强,初次建堆时(0 d)和其余翻堆时(第8、20、26天)次之,发酵结束时(第34天)最弱.Simpson、Shannon-Wiener和McIntosh多样性指数表明,建堆时及翻堆时的菌群优势度、丰富度和均匀度均极显著优于好氧堆肥结束.不同好氧发酵时间的微生物群落对同一碳源代谢有差异,同一好氧发酵时间微生物群落对不同碳源的利用率不同.糖类、酸类和醇类是区分好氧堆肥不同时间微生物碳源利用差异的敏感碳源.好氧堆肥不同时间细菌的种类和丰度不同,共享的优势菌门有厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes),在第0、8、14、20、26、34天这6个时间内它们的相对丰度之和分别达90.27%、90.34%、94.26%、84.21%、84.31%和77.61%,且6种门类在不同发酵时间的丰度表达存在消长变化状态.研究显示,参与好氧堆肥不同时间的微生物群落在碳源代谢能力上存在多样性,在细菌菌群的种类和丰度上也存在多样性.
关键词好氧堆肥    微生物群落演替    Biolog法    碳源代谢能力    宏基因组学    细菌菌群结构    
Microbial Metabolism Diversity and Bacterial Flora Structure during Aerobic Composting
WANG Xiuhong , LI Xinxin , SHI Xiangyuan , WANG Baoping , ZHOU Jing , JI Zengshun     
Modern Agricultural Research Center of Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China
Abstract: The aerobic fermentation composting is an effective way for the harmless disposal and resource utilization of agricultural waste. The present study is aimed at screening effectively degrading strains for improving composting process by exploring metabolic characteristics and microbial community and understanding the dominant bacteria during aerobic fermentation process. Biolog and metagenomic methods were used to analyze the carbon source metabolic capacity of microorganisms and bacterial community diversity for aerobic fermentation compost with corn stalk and cow manure. The results showed that the ability of carbon sources utilization for microorganisms was the strongest at the second turning (the 14th day), and the early establishment of a composting (0 d) was in the second place, such as the same with the other periods of turning (the 8th, 20th and 26th day), and the weakest one was at the end of aerobic fermentation (the 34th day). The diversity indices of Simpson, Shannon and McIntosh showed that dominance, richness and evenness for microbial community in the early establishment of a composting and the different turnover composting period were significantly better than those at the end of fermentation. The same carbon source metabolism differed to microbial communities at the different fermentation time, and the microbial community had different utilization of different carbon sources at the same fermentation period. Carbohydrates, acids and alcohols were sensitive carbon sources that could differentiate utilization variance of the microbe carbon sources from different time of aerobic compost. The species and abundances of bacteria were different at different periods of aerobic fermentation. Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Actinobacteria and Planctomycetes were the dominant groups on the phylum level. The sum of their relative abundances in the six periods were respectively 90.27%, 90.34%, 94.26%, 84.21%, 84.31% and 77.61%, and the abundances of six phyla existed changing state of growth and decline during different fermentation. It showed that the microbial communities involved in the aerobic compost at different time had diversity in carbon source metabolism, and their bacterial flora structure was different in species and abundance.
Keywords: aerobic compost    microbial community succession    Biolog method    carbon metabolism    metagenomics    bacterial flora structure    

好氧堆肥是农业废弃物无害化处理和资源化利用的一条有效途径.堆肥的实质是微生物分解和转化有机物的生化代谢过程,微生物群落的代谢能力和菌群结构是影响好氧堆肥效果的关键因素,了解和掌握微生物代谢特征和组成丰度对于揭示发酵过程中的有机物降解机制和发现新的降解菌群具有重要的理论意义和实践价值[1].

Biolog法是目前已知的研究微生物代谢功能多样性的有效方法之一[2].该方法多用于不同环境条件下土壤微生物群落代谢的差异研究[3-5],而用于堆肥中微生物群落多样性的研究报道较少.利用Biolog微平板分析法,Insam等[6]研究了开仓式堆肥中微生物群落结构的变化,Atkinson等[7]则确定了以果皮纸屑为原料的好氧堆肥过程中微生物群落结构特征,杨玖等[8]探讨了磺胺甲噁唑对猪粪堆肥过程中微生物群落功能多样性的影响.从群落角度来看,Biolog法是研究微生物群落功能多样性的一种简单、快速的方法,可以从代谢方面比较好氧堆肥微生物群落的不同[9].

利用宏基因组学进行堆肥微生物群落多样性的研究逐渐增多,通过该技术能够获得堆肥生境中微生物菌群组成的准确信息[10]. Martins等[11]首次通过高通量测序技术对堆肥生境的微生物总DNA进行测序,获得300×104条序列,并发现变形菌门的乳酸杆菌在该堆肥生境中占据优势,开启了对堆肥生境中高效降解菌群及其基因资源的认识;Neher等[12]利用高通量测序了解到堆肥的原料配比、堆制方式和不同堆肥阶段,其细菌和真菌在分类上表现出不同类别的优势物种;de Gannes等[13]用454-焦磷酸测序技术分析了以木质纤维素为主要原料堆肥3个主要发酵阶段的细菌和真菌的主导门类.可见,高通量测序技术在堆肥生境中分析微生物群落结构变化上具有明显优势,它从物种层次及分类角度对不同微生物菌群有了更全面地解读.

沈其荣等[14]研究表明,堆肥的有效降解主要发生在建堆后的30 d左右,此阶段主要为好氧发酵,而且细菌菌群是该阶段的主要优势种群[15].所以该研究将Biolog技术和宏基因组技术相结合,对以玉米秸秆和牛粪为主要原料的好氧发酵堆料中的微生物分别进行碳源代谢研究和细菌菌群分析,以了解好氧堆肥过程中微生物的代谢能力,明确不同发酵时间起作用的细菌物种分类,为筛选新菌种指明研究方向,从而改进堆肥工艺,提高腐熟效果.

1 材料与方法 1.1 材料来源

主要原料为玉米秸秆及干牛粪,均来自山西省农业科学院榆次东阳试验基地及周边养殖户.

1.2 试验方法 1.2.1 好氧发酵堆肥及采样方法

将玉米秸秆粉碎至3~5 cm长,按一定比例与干牛粪混合,配以豆饼、过磷酸钙和石膏等辅料,将C/N调节至30左右,混合均匀,堆料含水量为65%~70%,条垛堆大小为3 m×1.5 m×1.35 m(长×宽×高).建堆1周左右进行人工翻堆,堆料内外混合均匀,重新快速建堆.在初次建堆时(0 d)、4次翻堆时(第8、14、20、26天)以及发酵结束时(第34天),将堆体长度均分为6段,分别在距底部70 cm高度处和距外侧45~60 cm之间区域(该区域温度变化稳定)的中间5个横截面上取样,样品混合均匀,部分鲜样保存于4 ℃用于Biolog分析,部分鲜样保存于-80 ℃用于宏基因组检测.

1.2.2 Biolog检测

微生物群落碳源代谢测定采用Biolog生态板(Biolog ECO MicroPlate,产自美国Marix Technologies Corporation).称取新鲜样品4 g,加入36 mL无菌生理盐水,160 r/min下振荡1 h,静置片刻后用无菌生理盐水将上清液逐级稀释至稀释度为10-3,分别取150 μL稀释液接种于ECO板的每一个孔中,每个样品3次重复,同时设置对照,28 ℃生化培养箱中连续培养7 d,每24 h在酶标仪上(SpectraMax M2E,美国Molecular Devices)读取590和750 nm波长下的吸光度值.参照武爱莲等[16]的方法,将单孔在590和750 nm的吸光度值分别减去各自对照孔的吸光度值,再用获得的每个对应孔590 nm的值减去750 nm的值得到单孔实际颜色反应的吸光度值.利用该实际吸光度值,采用Garland等[17]的方法计算单孔平均吸光度值,即AWCD(average well color development,平均颜色变化率).

$ {\rm{AWCD}} = \sum\limits_{i = 1}^{31} {({A_i} - {A_0})/31} $ (1)

式中,Ai为第i孔的实际吸光度值,A0为对照孔的吸光度值,Ai-A0为第i孔的相对吸光度值(Ai-A0为负值时则归为0),31为Biolog ECO板的碳源种类数,AWCD值为3次重复的平均值.

采用培养96 h的吸光度值计算不同发酵时间微生物群落的多样性指数[18],该研究选择Simpson、Shannon-Wiener和McIntosh这3个指数来表征好氧发酵过程中微生物群落功能代谢多样性.

Simpson指数(D):

$ D = \sum\limits_{i = 1}^{31} {{p_i}^2} $ (2)

其中,${p_i} = ({A_i} - {A_0})/\sum\limits_{i = 1}^{31} {({A_i} - {A_0})} $

Shannon-Wiener多样性指数(H'):

$ H' = - \sum\limits_{i = 1}^{31} {{p_i}(\ln {p_i})} $ (3)

McIntosh指数(U):

$ U = \sqrt {\sum\limits_{i = 1}^{31} {{n_i}^2} } $ (4)

式中,pi为第i孔的相对吸光度值与整个微平板的相对吸光度值总和的比值,ni为第i孔的相对吸光度值(Ai-A0).

对培养96 h的吸光度值用平均色度值校正后用于主成分分析(principal component analysis, PCA).

1.2.3 细菌高通量测序

参照OMEGA试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的方法提取堆料细菌基因组DNA.利用通用引物(341F和805R)扩增16S rRNA基因的V3-V4区域,341F引物序列为CCTACGGGNGGCWGCAG,805R引物序列为AGACTACHVGGGTATCTAATCC. PCR反应体系:2×Taq master Mix 15 μL,Bar-PCR primer F(10 μmol/L) 1 μL,Primer R(10 μmol/L)1 μL,Genomic DNA 10~20 ng,加无菌水定容至30 μL. PCR反应条件:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,45 ℃退火20 s,65 ℃延伸30 s,共5个循环;94 ℃变性20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,共20个循环;72 ℃延伸5 min. PCR产物经琼脂糖电泳、回收纯化,利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对DNA精确定量,样品等比例混合于上海生工生物工程股份有限公司进行16S rRNA宏基因组测序.

1.2.4 物种分类

利用Usearch软件将所有样本按照序列间的距离进行聚类,根据序列之间的相似性将序列分成不同的OTU(operational taxonomic units,操作分类单元).对97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析,在OTU聚类结果的基础上,选择相对丰度最高的序列作为OTU的代表性序列,利用基于Bergey's taxonomy的RDP classifier分类方式对OTU进行物种分类.

1.2.5 数据统计分析方法

采用Microsoft Excel 2007软件作图,以SPSS 21.0统计分析软件进行主成分分析和方差分析,并用Duncan's多重比较法进行差异显著性检验.

2 结果与分析 2.1 发酵不同时间微生物群落对碳源利用能力的比较

AWCD表示微生物群落对底物碳源的利用程度,可衡量堆肥微生物对不同碳源的整体利用能力[19].通过对ECO板的31种碳源进行检测,发酵不同时间的AWCD值随培养时间的延长均呈不断增长的趋势,说明随着培养时间的延长,碳源被利用幅度增加,微生物代谢活性持续增强(见图 1).在整个发酵期间,以第14天时AWCD值上升较快,并且在不同培养时间内AWCD值均为最高,第0、8、26天的AWCD值差异不明显,第20天的样品在培养72 h前利用碳源的能力较弱,AWCD值上升缓慢,但在培养96 h后上升加快,培养到168 h时其AWCD值仅次于第14天,第34天AWCD值最低,且与前5个发酵时间的AWCD值呈极显著差异(P < 0.01).

图 1 不同发酵时间AWCD值随培养时间延长的变化 Fig.1 The value of AWCD at different fermentation time varied with the culture time
2.2 微生物群落碳源代谢能力多样性分析

根据不同发酵时间微生物的碳源利用情况,综合考虑其变化趋势,选取光密度趋于稳定,且不同时间均有较好分型的培养96 h的AWCD值进行微生物群落代谢多样性分析. Simpson指数是评估某些最常见种优势度的指数,由表 1可知,在第8、14、20天微生物菌群的优势度均升高,到第26天和第34天菌群物种的优势度下降,表现出差异极显著(P < 0.01). Shannon-Wiener多样性指数是评估物种丰富度的指数,相比初次建堆,第8天和第14天菌群物种的丰富度升高,后期又逐渐下降. McIntosh指数用于评估群落物种均匀度,在第0、8、14、26天微生物群落物种均匀度均较高,在第34天群落物种均匀度显著下降.说明在好氧发酵不同时间呈现出微生物群落多样性,发酵初期及翻堆期的菌群优势度、丰富度和均匀度均极显著优于发酵结束(P < 0.01).

表 1 好氧发酵微生物群落多样性指数 Table 1 Diversity index of microbial community during aerobic fermentation
2.3 微生物群落碳源利用分析

对不同碳源底物的利用差异分析,有助于更全面了解发酵不同时间微生物菌群对有机物碳源的降解与转化能力的差异[20].由图 2可知,在初次建堆时(0 d),微生物群落对糖类的代谢较低,利用率仅占总碳源的15.55%,第8天达到25.40%,随着发酵时间的延长,糖类代谢逐渐减弱,第34天仅占7.12%.氨基酸类代谢则是随着堆制时间的延长从14.84%升至22.19%,到第34天时稍微减弱.酯类代谢除第8天外,其余阶段利用率均在20%以上,说明微生物菌群对酯类代谢较高.在发酵不同时间,醇类利用率为11.20%~19.13%,第26天最高,第34天最低;胺类利用率为10.46%~19.88%,第34天最高,第20天最低;酸类利用率为13.01%~19.88%,第14天为最高,第26天为最低.结果表明,发酵不同时间的微生物群落对同一碳源的代谢有差异,同一发酵时间对不同碳源的利用丰度不同.

图 2 不同好氧发酵时间微生物群落对6类碳源的利用率 Fig.2 Utilization efficiency of 6 types of carbon sources by microbial communities at different aerobic fermentation time
2.4 主成分分析

对好氧发酵不同时间微生物利用单一碳源特性进行主成分分析.提取特征值大于1的主成分的特征根及方差贡献率,共提取出5个主成分(principal component, PC),累计贡献率达100%.其中PC1(第1主成分)和PC2(第2主成分)的累计贡献率达64.78%,可以表征好氧发酵过程中微生物群落代谢的基本情况,所以对PC1和PC2进行微生物功能多样性分析(见表 2).由表 2可知,对PC1上载荷值大于0.5的碳源有11种,对PC2载荷值大于0.5的碳源有11种.综合PC1和PC2,得出载荷值较大且种类较多的糖类(6种)、酸类(5种)和醇类(3种)是区分好氧发酵不同时间碳源利用差异的敏感碳源.

表 2 ECO微孔板中31种碳源在PC1和PC2上的载荷值 Table 2 Load value of 31 carbon sources on PC1 and PC2 in ECO micro-plate
2.5 不同发酵时间细菌在门水平上的组成及相对丰度

图 3表明,参与玉米秸秆好氧发酵阶段的主要细菌菌群包括厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、Candidatus Saccharibacteria、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus).厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、放线菌门和浮霉菌门是整个发酵期间的优势菌门,6个时间内它们的相对丰度之和分别达90.27%、90.34%、94.26%、84.21%、84.31%和77.61%. 6种细菌门类在不同发酵时间的表达丰度不同,厚壁菌门在建堆初期(0 d)相对丰度为55.59%,第14天升至75.69%,其余时间稍低,到发酵结束时(第34天),降至9.46%.变形菌门除了第14天有较低丰度,其余时间均较高.拟杆菌门的相对表达丰度在发酵期间高低交替,最低为0.29%,最高达36%.绿弯菌门的相对丰度在第26天和34天分别达到22.61%和16.3%.放线菌门的表达相对丰度为3.21%~6.08%.浮霉菌门的表达丰度较低,但有4个时间的相对丰度大于1%.不同发酵时间的优势门类数目呈增加趋势,第0、8、14、20、26、34天相对丰度大于1%的优势门类分别为3、5、4、10、9和11种,说明好氧发酵期间细菌菌群的种类和数量均处在消长变化状态.

图 3 不同发酵时间细菌群落在门水平上的组成和相对丰度 Fig.3 Bacterial community composition and relative abundance on phylum level at different fermentation time
3 讨论

AWCD用来表示堆肥微生物的平均活性,其值越高,说明微生物群落的代谢活性就越强[21].该研究前5个发酵时间的AWCD值均较高,说明初次建堆和翻堆期,堆体有机质含量较高,且经过翻堆待分解有机物得到重新分配[22],微生物代谢活动随之增强,堆体温度均处于50 ℃高温的时间累计达到22 d,说明对碳源的利用能力较高.发酵结束时AWCD值降低,吴艳萍等[23]认为,这可能是由于堆体中的营养物质随着时间的延长被微生物所消耗,以及产生了某些生长抑制物质导致微生物活性下降. El Fels等[24]研究认为,随着堆料腐熟程度的提高,无论是中温菌和高温菌数目均会有大幅下降,也会导致微生物活性减弱. Simpson、Shannon-Wiener和McIntosh多样性指数分析表明,翻堆期的菌群优势度、丰富度和均匀度均极显著高于发酵末期,说明微生物利用碳源能力的多样性受堆体的透气性、堆体内可溶性有机物的含量以及堆料分解快慢的影响,表现为发酵不同时间的微生物群落对同一碳源的代谢存在差异,同一发酵时间对不同碳源的利用丰度不同.

Antunes等[25]研究表明,堆肥高温期的细菌优势门类占总分类reads的85%.张丽丽[26]用玉米秸秆作为主要原料进行自然堆肥,共鉴定到了24个细菌门类,主导门类厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门共占到样品总分类reads的93.5%.该研究利用玉米秸秆和牛粪为主要原料进行好氧堆肥,在堆肥期间共检测到30种细菌门类,厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、绿弯菌门、放线菌门和浮霉菌门为6个主导菌门.绿弯菌门是一种兼性厌氧生物[27],推测是由于发酵料含水量偏高,堆体偏紧实,兼性厌氧菌发挥作用的结果.

已有报道[28-31]表明,厚壁菌门的嗜热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacilli)、芽孢杆菌属(Bacillus)和梭菌属(Clostridium),放线菌门的喜热裂孢菌属(Thermobifida)、嗜热多孢菌属(Thermopolyspora)、高温单孢菌属(Thermomonospora),变形菌门的假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)和纤维弧菌属(Cellvibrio)是与好氧发酵堆肥中木质纤维素降解有关的细菌菌属.李红亚等[32]从牛粪中筛选到一株芽孢杆菌属降解细菌MN-8,木质素降解率可达24%.笔者通过平板培养法从玉米秸秆堆肥中筛选出3株芽孢杆菌属菌株,其纤维素降解能力分别为9.9%、18.5%和25%,筛选出一株多功能链霉菌属(Streptomyces)菌株,其纤维素降解能力为28%.所以,结合好氧堆肥过程中微生物的功能和结构多样性分析来指导菌种筛选,将成为一条有效的微生物强化堆肥的技术手段.

4 结论

a) 以玉米秸秆和牛粪联合的好氧堆肥过程中,不同发酵时间的微生物菌群对碳源的利用能力存在多样性,以第14天的微生物群落利用碳源的能力最强,第0、8、20、26天次之,第34天最弱;发酵不同时间的微生物群落对同一碳源代谢有差异,同一发酵时间对不同碳源的利用丰度也不同;糖类、酸类和醇类是区分好氧发酵不同时间微生物菌群碳源利用能力差异的敏感碳源.

b) 不同好氧发酵时间细菌的种类和丰度不同,表现为细菌菌群结构多样性.共享的优势菌门类有厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、放线菌门和浮霉菌门,6种门类在不同发酵时间的表达丰度存在消长变化状态.该研究从门水平上了解了玉米条垛式好氧发酵过程起关键作用的细菌菌群,为下一步更全面地分析堆肥微生物、分离功能强化菌株奠定基础.

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