环境科学研究  2020, Vol. 33 Issue (7): 1711-1720  DOI: 10.13198/j.issn.1001-6929.2020.06.11

引用本文  

夏湘勤, 唐朱睿, 黄彩红, 等. 环丙沙星胁迫猪粪生物转化中抗性基因微生物响应分析[J]. 环境科学研究, 2020, 33(7): 1711-1720.
XIA Xiangqin, TANG Zhurui, HUANG Caihong, et al. Microbial Response to Antibiotic Resistance Genes in Manure Biotransformation Under Ciprofloxacin Stress[J]. Research of Environmental Sciences, 2020, 33(7): 1711-1720.

基金项目

国家重点研发计划项目(No.2019YFC1906401);国家自然科学基金项目(No.51508540)
National Key Research and Development Program of China (No.2019YFC1906401); National Natural Science Foundation of China (No.51508540)

责任作者

黄彩红(1976-), 女, 山东五莲人, 副研究员, 博士, 主要从事固体废物资源化研究, huangch@craes.org.cn.

作者简介

夏湘勤(1994-), 女, 湖南邵阳人, vanila_xia@126.com

文章历史

收稿日期:2020-04-01
修订日期:2020-05-26
环丙沙星胁迫猪粪生物转化中抗性基因微生物响应分析
夏湘勤1,2,3, 唐朱睿1,2, 黄彩红1,2, 席北斗1,2, 郭威1,2    
1. 中国环境科学研究院, 环境基准与风险评估国家重点实验室, 北京 100012;
2. 中国环境科学研究院, 国家环境保护地下水污染过程模拟与控制重点实验室, 北京 100012;
3. 桂林理工大学环境科学与工程学院, 广西 桂林 541006
摘要:抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)是一种新兴污染物,持续累积会引发环境健康风险,也可通过水平转移诱导耐药细菌产生,从而危害人类健康与国家生物安全.当前关于ARGs的研究多集中于水、土壤、大气等环境介质,固体废弃物领域ARGs研究尚局限于其丰度变化与影响因素方面,对抗生素-ARGs剂量-效应关系、导致ARGs丰度变化的微生物响应机制仍有待深入研究.基于此,开展了不同浓度水平环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)胁迫下猪粪堆肥试验,环丙沙星添加量分别为25 mg/kg(A25)、50 mg/kg(A50)、100 mg/kg(A100),同时设置空白对照0 mg/kg(CK).采用分子生物学手段、网络分析、统计学分析等方法,解析了不同浓度环丙沙星胁迫猪粪好氧堆肥过程中喹诺酮类ARGs丰度变化的微生物响应关系,并重点探讨了潜在宿主菌中致病菌的分布及其与ARGs的相关性.结果表明:①经堆肥处理,CK、A25和A100堆体中喹诺酮类ARGs总丰度均受到不同程度削减,A50堆体中ARGs总丰度未被削减(升高2.73倍).而高温期除CK外,3个处理组中ARGs丰度均显著降低(P < 0.05),表明堆肥高温期或是削减ARGs的关键阶段.②狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)、水微菌属(Aquamicrobium)、乳杆菌属(Lactobacillus)及交替赤杆菌属(Altererythrobacter)既是堆肥环境中优势菌属,也是喹诺酮类ARGs潜在宿主微生物,主要分布在厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria).③丰度较高的致病菌Clostridium_sensu_stricto_1和链球菌(Streptococcus)是喹诺酮类ARGs的潜在宿主菌,且至堆肥腐熟期,仍有部分致病菌均未被完全去除,可见猪粪堆肥过程中存在ARGs向致病菌转移的环境健康风险.研究显示,加强高温期干预调控,是有效阻控ARGs环境污染行为的关键节点,研究可为固废资源化过程中ARGs环境健康风险防控提供参考.
关键词环丙沙星    猪粪    抗性基因    生物转化    致病菌    
Microbial Response to Antibiotic Resistance Genes in Manure Biotransformation Under Ciprofloxacin Stress
XIA Xiangqin1,2,3, TANG Zhurui1,2, HUANG Caihong1,2, XI Beidou1,2, GUO Wei1,2    
1. State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China;
2. Innovation Base of Ground Water&Environmental System Engineering, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China;
3. College of Environmental Science and Engineering, Guilin University of Technology, Guilin 541006, China
Abstract: Antibiotic resistance genes (ARGs), an emerging pollutant, cause health risks by accumulation in environment. It also induces the production of resistant bacteria through gene horizontal transfer, endangering human health and national biosecurity. Currently, research on ARGs is concentrated on wastewater, soil, and aerosol. However, scientific issues such as microbial driving mechanisms are still unclear, and the microbial response to abundance of ARGs remains to be further studied. Herein, manure composting experiments were conducted at four concentration levels (0, 25, 50, 100 mg/kg) of Ciprofloxacin stress. The response mechanism of ARGs abundance and microbial community structure was analyzed based on molecular biology, network analysis and statistical analysis. The distribution of pathogenic bacteria in potential host bacteria and their correlation with ARGs were discussed. The results showed that after composting, the total abundance of quinolones ARGs in CK, A25 and A100 all decreased to varying degrees, but the total abundance of ARGs in A50 did not decrease. During high temperature composting, in addition to CK, the abundance of ARGs in the treatment groups decreased significantly (P < 0.05). Clostridium_sensu_stricto_1, Aquamicrobium, Lactobacillus and Altererythrobacter were the dominant genus of bacteria in manure compost. They were also potential host microorganisms for quinolones ARGs, mainly distributed in Firmicutes and Proteobacteria. Highly abundance pathogenic bacteria Clostridium_sensu_stricto_1 and Streptococcus were potential host bacteria for quinolones ARGs. The pathogenic bacteria in the four composts were not removed completely on the 46th day of composting maturity. In summary, there is an environmental health risk of transferring ARGs to pathogenic bacteria in a pig manure composting environment. The high-temperature period is a key stage to control the environmental pollution of ARGs.
Keywords: Ciprofloxacin    pig manure    resistance gene    biotransformation    pathogenic bacteria    

抗性基因(Antibiotic Resistance Genes, ARGs)是导致微生物拥有抗生素抗性的元凶,特别是存在于致病菌中时,会造成严重环境健康风险.据WHO (World Health Organization, 世界卫生组织)2018年发布的数据显示,无论发达国家还是发展中国家抗生素耐药菌发病率均居高不下[1].在欧盟地区,每年因耐药菌感染造成超过25 000×104人死亡,并造成经济损失超过15×108美元[2].在美国,每年至少200×104人的疾病和23 000人的死亡是由于抗生素抗性所导致[3].而此次新型冠状病毒肺炎疫情期间,医疗卫生体系中大量药物使用,也可能会加剧ARGs在环境中的累积和传播.这些ARGs能够转移至与人类相关的微生物,如转移至某些烈性致病菌(如鼠疫病原菌等),将会对人类健康造成威胁.因此,微生物耐药性是一种“不定时炸弹”,一旦暴发后果不堪设想. WHO已宣布在全球范围部署防控ARGs,并将微生物耐药性列为21世纪人类面临的最大挑战之一[4].

我国是世界上最大的抗生素生产国和使用国,仅2013年,生产了16.20×104 t抗生素,其中48%被用于医学使用,其余部分则用于畜禽养殖业[5].而氟喹诺酮类抗生素(Fluoroquinolones, FQs)作为一种广谱抗菌抗生素广泛用于畜禽养殖,其中以环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)为典型代表[6].我国畜禽粪便中环丙沙星平均残留浓度在0.49~45.6 mg/kg之间[6-7].然而,大多数抗生素不能被动物完全代谢,其摄入剂量的30%~90%以原型药物和代谢产物形式排出[8].因此,畜禽粪便中残存抗生素会通过选择性压力诱导ARGs的产生,使其成为潜在的耐药菌和ARGs储藏库[9-10]. 2015年我国畜禽粪污产生量约为1.91×109 t,其中猪粪产生量为6.5×108 t,猪粪在总畜禽粪污中占比最高[10],且猪粪中ARGs丰度要高于其他畜禽粪污[11],表明猪粪中ARGs的环境风险更大.

好氧堆肥作为无害化和资源化再利用有机固废的一种重要技术手段,其产品广泛用于农业、园艺和土壤修复[12].好氧堆肥能够有效削减抗生素进而减少残留抗生素进入土壤环境,而ARGs具有可复制性、可在微生物间水平转移等生物学特点,使得ARGs的削减在堆肥过程中变化规律不尽相同.笔者所在课题组研究了生活垃圾好氧堆肥过程中ARGs的丰度变化趋势及影响因素,发现在堆肥高温期ARGs丰度显著升高,腐熟阶段降低.同时,经过堆肥处理能够削减致病菌的丰度,这些致病菌种包括一些潜在宿主微生物[13].猪粪中往往会残留一定量的抗生素,可能会胁迫产生ARGs,鉴于猪粪产生量大,且当前我国畜禽粪便资源化技术与管理中尚没有对ARGs等累积型新兴污染物的控制标准.因而,有必要开展猪粪堆肥过程中ARGs丰度特征与影响因素研究.基于此,该研究选取猪粪作为研究对象,选择环丙沙星作为典型抗生素类型,以关键微生物解析为重点,研究残留环丙沙星猪粪堆肥过程中ARGs丰度变化特征及其与微生物响应关系,为猪粪无害化促进资源化利用提供科学支撑.

1 材料与方法 1.1 堆肥与样品采集

猪粪物料取自北京东华山村沼气站(猪粪中环丙沙星本底值的平均浓度为0.89 mg/kg),锯末取自附近木材厂,环丙沙星(C17H18FN3O3)购自上海MACKLIN公司,堆肥物料的理化性质见表 1.两台自动化堆肥设备购自日本静冈机械有限公司,高0.4 m,直径0.33 m,总容积0.034 m3,设有渗滤液收集装置、供气计量系统及温度调节装置.

表 1 堆肥初始物料理化性质 Table 1 Chemical properties of compost materials

采用特制有机玻璃隔板将堆肥装置分为4个反应区,即4个堆体,每个堆体中添加猪粪和锯末共8 kg.猪粪和锯末按4 :5的质量比混合,使得C/N为25 :1左右,含水率为57.84%~60.00%,保证连续通风状态,通风量为4 L/min. 4个反应区环丙沙星添加量分别为0 mg/kg(CK)、25 mg/kg(A25)、50 mg/kg(A50)、100 mg/kg(A100).堆肥温度区间为22~58 ℃,高温期(>50 ℃)四个堆体均持续保持5~7 d.好氧堆肥周期为46 d,分别于第0、3、7、14、26、46天进行样品采集,均在堆体不同深度(表层以下5、10、15 cm处)取样,过20目(0.9 mm)筛并充分混合后,分装至自封袋(约50 g),干冰储存,用于后续试验开展.

1.2 DNA提取和实时荧光定量PCR

采用FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒提取样品总DNA,于-80 ℃下保存待分析.预试验后,选择4个质粒介导喹诺酮类药物耐药基因(Plasmid-mediated Quinolone Resistance Genes, PMQR)和1个可移动遗传元件(Mobile genetic elements, MGEs)作为目标基因,即(qnrSqnrDgyrAparC)和一个整合子(intl1),进行实时荧光定量PCR (qPCR)检测,设3次重复. PCR扩增条件可参考文献[13],引物设计如表 2所示. qPCR定量分析后的绝对丰度用copies/g表示.

表 2 目标ARGs和引物设计[14-16] Table 2 Target ARGs and primer design[14-16]
1.3 16S rDNA基因测序

将DNA样本送上海美吉生物制药科技有限公司进行16S rDNA基因测序.测序平台为Illumina MiSeq,构建MiSeq PE300库.用引物338F (ACTCCT ACGGGAGGCAGCAG)和806R (GGACTACHVGGGT WTCTAAT)对细菌进行PCR扩增.琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,OD260 nm和OD280 nm均高于1.55,满足后续试验条件.使用正式的PCR测试TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA聚合酶,20 μL反应系统包括10 ng模板DNA、0.8 μL正向引物(5 μmol/L)、0.8 μL反向引物(5 μmol/L)等. PCR热循环条件:95 ℃,持续3 min;35个循环,95 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 45 s;72 ℃下延长10 min. PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测,按97%的相似度,对所有序列进行OTU分区并进行生物信息统计分析.

1.4 数据统计与分析

利用SPSS 25.0软件和Origin 6.0软件对ARGs、MGEs和细菌群落的丰度及其相关性进行分析. ARGs丰度变化及微生物群落变化图用Excel 2016软件和R语言(pheatmap包)绘制.根据ARGs、MGEs和微生物间的Pearson相关系数(P < 0.05),采用Cytoscape 3.7.1软件对其进行网络分析.

2 结果与讨论 2.1 ARGs与可移动遗传元件丰度变化

依据堆体(CK、A25、A50、A100) 46 d内的温度变化,将堆肥的3个典型阶段划分如下,即升温期(第0~2天)、高温期(第3~10天)和腐熟期(第11~45天).其中,腐熟期也是堆肥的降温阶段,进一步分为降温前期(第11~27天)和降温后期(第28~46天).所取堆肥样品共24个,均检测出4个喹诺酮类抗性基因(qnrSqnrDgyrAparC)和一个移动遗传元件(整合子intl1).

2.1.1 喹诺酮类ARGs的丰度变化

堆体ARGs总丰度变化如图 1所示,经堆肥处理后,仅A50堆体中喹诺酮类ARGs总丰度升高,由初期的1.17×106 copies/g升至4.37×106 copies/g,增加了2.73倍;其他3个堆体(CK、A25、A100)中喹诺酮类ARGs总丰度均被削减,分别降低了95%、81%和98%.在堆肥腐熟产品中,喹诺酮类ARGs总丰度大小依次为A50>CK>A100>A25.其中,CK的喹诺酮类ARGs先在高温期第7天升高至峰值,随后降低,最后在腐熟期第46天略升高.处理组A25和A100堆体的喹诺酮类ARGs总丰度变化趋势相似,均在高温期第7天降至最低水平,随后在腐熟期略升高.从堆肥第0天到高温期第7天,对比4个堆体中ARGs变化丰度发现,CK组中喹诺酮类ARGs丰度升高,其他3个堆体(A25、A50、A100)中丰度则降低,分别降低了90%、85%和99%.高温期A25、A50和A100堆体中喹诺酮类ARGs均降低,这可能是由于添加环丙沙星影响了相关微生物菌群,从而影响喹诺酮类ARGs丰度变化. ZHANG等[17]发现抗生素施加产生的选择性压力对微生物群落有显著影响,与该研究的结果类似.

图 1 各堆肥中ARGs和MGEs的绝对丰度变化 Fig.1 Absolute abundance change of ARGs and MGEs during composting

各堆体中ARGs丰度变化具有差异性,结果(见图 1)显示,gyrA的绝对丰度最高,其平均丰度在1.34×105~4.21×105 copies/g之间,qnrS平均丰度在5.48×104~1.58×105 copies/g之间,qnrDparC的平均丰度甚至更低,分别在1.10×104~2.99×104、3.28×104~7.29×104 copies/g之间,其平均丰度大小依次为gyrA>qnrS>parC>qnrD. A50堆体中,3个基因qnrSqnrDgyrA丰度显著升高导致ARGs总丰度升高,而parC的丰度略有降低,对其总丰度升高趋势的影响较小.而堆肥第0天到高温期第7天,CK组中喹诺酮类ARGs总丰度升高,是由于除qnrD丰度降低了41%外,qnrSgyrAparC的绝对丰度均显著升高(P < 0.01),分别升高9.3、5.4和11.5倍,说明qnrSgyrAparC是导致CK堆体高温期ARGs总丰度升高至峰值的主要贡献基因.目前研究[17-18]认为,堆肥过程中微生物群落结构的组成变化是影响抗生素ARGs变化的主要原因. Selvam等[14, 19]研究发现在堆肥高温期过后,四环素ARGs与四环素类抗性细菌的变化都出现先升后降的趋势,表明同一类抗性细菌与ARGs的变化呈显著正相关.由此可见,堆肥微生物群落结构可能在ARGs丰度变化过程中扮演了重要角色.

2.1.2 移动遗传元件的丰度变化

移动遗传元件(MGEs)是参与ARGs水平转移的主要载体.结果(见图 1)显示,4个堆体中intl1的丰度变化较为相似,从开始到结束阶段均呈增长趋势,增长倍数分别为151.88倍(CK)、39.02倍(A25)、68.45倍(A50)、105.41倍(A100).其中,丰度增加最大的是CK堆体,由初始绝对丰度的8.23×106 copies/g增至1.25×109 copies/g.整个堆肥阶段,所有堆体中intl1的总丰度均比每个PMQR的丰度高2~4个数量级.有研究[20]认为,可移动遗传元件作为ARGs的载体比ARGs具有更高的丰度.研究[21-22]表明,MGEs的丰度变化类似于ARGs,且二者之间存在密切的关系. LIU等[23]在四环素废水处理系统中发现intl1与四环素类ARGs的增殖有关;DUAN等[24]发现intl1tetWermFsul1基因呈显著正相关,且sul1intl1之间相关性最强(R =0.994).但试验结果并未发现可移动遗传元件intl1与PMQR丰度变化有显著相关.这可能是由于携带4个喹诺酮类ARGs的作用MGEs并不是intl1,它们之间的潜在宿主没有共性.

2.2 微生物群落演替规律

堆肥24个样品中获得1 233 189个高质量序列,按最小样本序列数进行抽平,序列以97%的相似度聚类到1 468个OTU.稀释曲线表明,测序深度(29 371)可以检测样品中的大多数细菌群落.目前研究[18, 25]认为,细菌群落的演替可能会影响ARGs的丰度变化.结果(见图 2)显示,细菌群落组成在堆肥不同阶段表现出明显的聚集(P < 0.01).在堆肥高温期第7天微生物组成与其他阶段离散最大,说明高温期是堆肥细菌群落变化最显著的阶段.

注:D0、D3、D7、D14、D26和D46分别表示第0、3、7、14、26、46天中的4个堆体样品.下同. 图 2 各堆肥中基于OTU的细菌群落差异总体分布图(NMDS分析) Fig.2 Overall distribution pattern of OTU-based bacterial community dissimilarity during composting (non-metric multidimensional scaling)

堆肥不同阶段中细菌群落的α-多样性差异大(见表 3).在高温期第7天,4个堆体中Shannon-Wiener指数和ACE指数均明显降低,是整个堆肥阶段的最低水平,即第7天的堆肥中微生物多样性最低且物种数最少.这主要由于堆肥中嗜温性细菌无法在高温期生存,会随着温度升高而降低[26].抗生素对堆肥微生物群落多样性有一定的影响,到堆肥腐熟阶段,A100堆体的Shannon-Wiener指数和ACE指数均低于其他3组,说明高浓度抗生素可能会降低堆肥产品中微生物多样性.为进一步了解PMQR与堆肥微生物多样性及生物量的相关性,将Shannon-Wiener指数、ACE指数与PMQR、MGEs丰度进行统计分析,发现CK、A25堆体中,intl1和微生物多样性呈显著相关(P < 0.05).这说明可移动遗传元件intl1的丰度变化与堆肥中细菌群落组成结构的改变有关,但是否与携带PMQR的潜在宿主有相关性还需进一步探究.

表 3 猪粪堆肥4个处理组中不同阶段的细菌多样性指数 Table 3 Bacterial diversity index of pig manure composting in four treatment groups

微生物作为堆肥过程中的主力军,是ARGs和MGEs丰度变化的关键因素[27].堆肥微生物门水平群落组成见图 3,在所有堆肥样品中,占主导地位的菌门有放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi).与已有的研究[28-29]相似,Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria在整个堆肥环境中约占76.2%,是堆肥过程中主要菌门.

图 3 各堆肥中不同阶段门水平群落结构及分析 Fig.3 Community structure and analysis of phylum level in different stages of composting

为进一步解析微生物群落结构对ARGs丰度变化的影响,对堆肥不同阶段属水平群落结构进行分析.在前25个属(见图 4)中,狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)(占比为10.2%)、水微菌属(Aquamicrobium)(占比为9.4%)、乳杆菌属(Lactobacillus)(占比为9.4%)、交替赤杆菌属(Altererythrobacter)(占比为4.5%)、和黄杆菌属(Flavobacterium)(占比为4.0%)为优势菌属.其中,Clostridium_sensu_stricto_1Lactobacillus,作为Firmicutes的主要菌属,主要出现在堆肥升温期和高温期,而其他3种菌属主要分布在腐熟期. LIAO等[20]研究厨余垃圾堆肥中ARGs潜在宿主微生物发现,堆肥不同阶段微生物群落具有差异性,高温期的优势菌属为芽孢杆菌(Bacillus)、海洋芽孢杆菌(Oceanobacillu)和棒状杆菌(Corynebacterium),说明不同物料堆肥中优势菌属具有差异性.

图 4 各堆肥中不同阶段属水平群落结构及分析 Fig.4 Community structure and analysis of genus level in different stages of composting

畜禽粪便是病原微生物的主要载体,一些病原细菌(在物种水平上)携带了ARGs[30].尽管病原菌的相对丰度较低,仍存在一定的环境风险.该研究中检测出的主要10种致病菌的丰度变化情况见图 5.由图 5可见,随着堆肥进行,病原微生物的相对丰度(属水平)逐渐降低,而多样性增加.这可能是由于堆肥高温期会抑制病原微生物生长,使得病原微生物总体丰度降低.而腐熟期堆肥反应条件较温和,有利于整体微生物菌群的多样性增加,其中包括部分病原菌.根据美国EPA标准[31],当堆肥系统满足一定条件,即40 ℃以上维持工作5 d且超过55 ℃至少持续4 h,才能实现病原体的有效灭活.试验中4个堆体高温期的温度变化均已达到美国EPA灭活标准,但病原菌均未能完全被去除.检测发现4个堆体中10种病原菌的初始总相对丰度为4.75%,经堆肥46 d后,CK、A25、A50和A100堆体的去除率分别为73.2%、77.7%、87.8%和79.2%. Soobhany[32]在城市有机固废堆肥试验中发现,堆肥可减少大肠杆菌数量,但不能完全灭活该微生物.同样,Pourcher等[33]研究显示,即使温度高达66 ℃也不能完全使病原菌失活.此外,研究发现堆肥高温期第7天,4个堆体中病原菌去除率分别为69.0%(CK)、54.6%(A25)、51.1%(A100)、45.8%(A50),致病菌的相对丰度均降低了45%以上,说明高温期是去除致病菌的主要阶段.

图 5 堆肥过程中致病菌(属水平)的相对丰度变化 Fig.5 The relative abundance of pathogenic bacteria classified to genus level during composting
2.3 潜在宿主菌和ARGs共现分析

试验中4个堆体为相对独立的堆肥体系,而不同抗生素浓度胁迫下,堆体中宿主微生物存在差异性.为了进一步解析ARGs的潜在宿主微生物,进行了不同堆体中潜在宿主菌的网络共现分析识别(见图 6).由图 6可见,堆肥环境中与PMQR相关的潜在宿主菌一共有17种,其中8种为致病菌.这些潜在宿主菌主要分布在厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)中,尤其是厚壁菌门、变形菌门的潜在宿主菌数量最多,丰度最高.所有潜在宿主中,仅发现属于放线菌门的白喉杆菌(Corynebacterium)与intl1呈显著负相关(P < 0.05),其他宿主菌均与PMQR、MGEs呈显著正相关(P < 0.05).已有研究[34-36]也表明,Firmicutes和Proteobacteria可能是与ARGs水平转移相关的主要菌门.所关注的前10种致病菌中除芽孢杆菌和假单胞菌(Pseudomonas)外,其他均为潜在宿主.其中,Streptococcus作为潜在宿主菌在4个堆体中均存在;在A25堆体的ModuleⅡ中,发现Clostridium_sensu_stricto_1不仅是4个PMQR的共同潜在宿主,也是致病菌中丰度最高的菌属,表明猪粪堆肥环境中存在ARGs向致病菌转移的环境健康风险.因此,建议在25 mg/kg环丙沙星环境中,以堆肥技术控制削减PMQR时,Clostridium_sensu_stricto_1应作为需首要关注的作用微生物. Jechalke等[37]研究表明,intl1位于质粒和转座子上,侧翼是插入序列,该序列通常与ARGs变化具有相关性.但是,关于潜在宿主与可移动遗传元件intl1共现分析(见图 6).由图 6可见:A25、A50、A100堆体中,可移动遗传元件intl1的潜在宿主菌与影响PMQR变化的潜在宿主没有共性;CK堆体中,也仅发现白喉杆菌是intl1qnrS的共同潜在宿主.综上,整合子intl1所在的ARGs簇可能没有携带这4种喹诺酮类ARGs,所以intl1与ARGs丰度相关性不显著.

注:三角形(△)表示致病菌(P.genus),圆圈(○)表示细菌(Genus),正方形(□)表示MGE,菱形(◇)表示PMQR;粉色填充表示厚壁菌门(Firmicutes),蓝色填充表示变形菌门(Proteobacteria),绿色填充表示拟杆菌门(Bacteroidetes),黄色填充表示放线菌门(Actinobacteria). 图 6 ARGs、MGEs和致病菌及优势菌属之间的网络分析 Fig.6 Network analysis between ARGs, MGEs and pathogenic bacteria or dominant bacteria classified to genus level
3 结论

a) 不同浓度环丙沙星胁迫下,猪粪堆肥过程中喹诺酮类ARGs的变化规律有所不同,CK、A25和A100堆体中喹诺酮类ARGs总丰度均受到不同程度削减,A50堆体中ARGs的总丰度反而升高.而在高温期,除了CK组,处理组中ARGs丰度显著降低(P < 0.05),分别降低了90%、85%和99%,表明堆肥高温期或是削减ARGs丰度的关键阶段.

b) 对ARGs丰度变化与微生物响应进行分析,发现狭义梭菌属、水微菌属、乳杆菌属和交替赤杆菌属既是堆肥环境中优势菌属,也是喹诺酮类ARGs潜在宿主微生物,主要分布在厚壁菌门和变形菌门.

c) 经46 d好氧堆肥,4个堆体中致病菌均未被完全去除,去除率分别为87.8%(A50)、79.2%(A100)、77.7%(A25)、73.2%(CK),且丰度较高的致病菌狭义梭菌属和链球菌均是喹诺酮类ARGs的潜在宿主菌,表明猪粪堆肥环境中存在ARGs向致病菌转移的环境健康风险.

参考文献
[1]
World Health Organization.High levels of antibiotic resistance found worldwide[EB/OL].Bangkok: Christian Lindmeier, 2018-01-29[2020-04-26].https://www.who.int/news-room/detail/29-01-2018-high-levels-of-antibiotic-resistance-found-worldwide-new-data-shows. (0)
[2]
钱勋.好氧堆肥对畜禽粪便中抗生素抗性基因的削减条件探索及影响机理研究[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2016. (0)
[3]
KENNEDY D. Time to deal with antibiotics[J]. Science, 2013, 342(6160): 777. DOI:10.1126/science.1248056 (0)
[4]
World Health Organization.Antimicrobial resistance: global report on surveillance[EB/OL].Geneva: WHO, 2014-06-04[2020-04-24].https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/112642. (0)
[5]
ZHANG Q Q, YING G G, PAN C G, et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China:source analysis, multimedia modeling, and linkage to bacterial resistance[J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(11): 6772-6782. (0)
[6]
夏湘勤, 黄彩红, 席北斗, 等. 畜禽粪便中氟喹诺酮类抗生素的生物转化与机制研究进展[J]. 农业环境科学学报, 2019, 38(2): 257-267.
XIA Xiangqin, HUANG Caihong, XI Beidou, et al. Review on biotransformation and mechanism of fluoroquinolone antibiotics from livestock manure[J]. Journal of Agro-environment Science, 2019, 38(2): 257-267. (0)
[7]
LING Z, HUA D, HUI W. Residues of veterinary antibiotics in manures from feedlot livestock in eight provinces of China[J]. Science of the Total Environment, 2010, 408(5): 1069-1075. DOI:10.1016/j.scitotenv.2009.11.014 (0)
[8]
CHENG D M, FENG Y, LIU Y W, et al. Quantitative models for predicting adsorption of oxytetracycline, ciprofloxacin and sulfamerazine to swine manures with contrasting properties[J]. Science of the Total Environment, 2018, 634: 1148-1156. DOI:10.1016/j.scitotenv.2018.04.114 (0)
[9]
ZHU L J, ZHAO Y, YANG K J, et al. Host bacterial community of MGEs determines the risk of horizontal gene transfer during composting of different animal manures[J]. Environmental Pollution, 2019, 250: 166-174. DOI:10.1016/j.envpol.2019.04.037 (0)
[10]
武淑霞, 刘宏斌, 黄宏坤, 等. 我国畜禽养殖粪污产生量及其资源化分析[J]. 中国工程科学, 2018, 20(5): 103-111.
WU Shuxia, LIU Hongbin, Huang Kunhong, et al. Analysis on the amount and utilization of manure in livestock and poultry breeding in China[J]. Strategic Study of Chinese Academy of Engineering, 2018, 20(5): 103-111. (0)
[11]
QIAN X, GU J, SUN W, et al. Diversity, abundance, and persistence of antibiotic resistance genes in various types of animal manure following industrial composting[J]. Journal of Hazardous Materials, 2018, 344: 716-722. DOI:10.1016/j.jhazmat.2017.11.020 (0)
[12]
PERGOLA M, PICCOLO A, PALESE A, et al. Composting:the way for a sustainable agriculture[J]. Applied Soil Ecology, 2018, 123: 744-750. DOI:10.1016/j.apsoil.2017.10.016 (0)
[13]
TANG Z R, XI B D, HUANG C H, et al. Mobile genetic elements in potential host microorganisms are the key hindrance for the removal of antibiotic resistance genes in industrial-scale composting with municipal solid waste[J]. Bioresource Technology, 2020. DOI:10.1016/j.biortech.2019.122723 (0)
[14]
SELVAM A, XU D L, ZHAO A Y, et al. Fate of tetracycline, sulfonamide and fluoroquinolone resistance genes and the changes in bacterial diversity during composting of swine manure[J]. Bioresource Technology, 2012, 126: 383-390. DOI:10.1016/j.biortech.2012.03.045 (0)
[15]
WU B, QI Q, ZHANG X, et al. Dissemination of Escherichia coli carrying plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes from swine farms to surroundings[J]. Science of the Total Environment, 2019, 665: 33-40. DOI:10.1016/j.scitotenv.2019.01.272 (0)
[16]
WANG L J, ZHAO X, WANG J H, et al. Macrolide- and quinolone-resistant bacteria and resistance genes as indicators of antibiotic resistance gene contamination in farmland soil with manure application[J]. Ecological Indicators, 2019. DOI:10.1016/j.ecolind.2019.105456 (0)
[17]
ZHANG R R, GU J, WANG X J, et al. Contributions of the microbial community and environmental variables to antibiotic resistance genes during co-composting with swine manure and cotton stalks[J]. Journal of Hazardous Materials, 2018, 358: 82-91. DOI:10.1016/j.jhazmat.2018.06.052 (0)
[18]
SU J Q, YANG W Y, WEI B, et al. Antibiotic resistome and its association with bacterial communities during sewage sludge composting[J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49: 7356-7363. (0)
[19]
仇天雷, 高敏, 韩梅琳, 等. 鸡粪堆肥过程中四环素类抗生素及抗性细菌的消减研究[J]. 农业环境科学学报, 2015, 34(4): 795-800.
QIU Tianlei, GAO Min, HAN Meilin, et al. Decreases of tetracyclines and antibiotics-resistant bacteria during composting of chicken manure[J]. Journal of Agro-environment Science, 2015, 34(4): 795-800. (0)
[20]
LIAO H, FRIMAN V P, GEISEN S, et al. Horizontal gene transfer and shifts in linked bacterial community composition are associated with maintenance of antibiotic resistance genes during food waste composting[J]. Science of the Total Environment, 2019, 660: 841-850. DOI:10.1016/j.scitotenv.2018.12.353 (0)
[21]
WANG L, WANG J, WANG J, et al. Distribution characteristics of antibiotic resistant bacteria and genes in fresh and composted manures of livestock farms[J]. Science of the Total Environment, 2019. DOI:10.1016/j.scitotenv.2019.133781 (0)
[22]
CHEN B, LIANG X M, NIE X P, et al. The role of class I integrons in the dissemination of sulfonamide resistance genes in the Pearl River and Pearl River Estuary, South China[J]. Journal of Hazardous Materials, 2015, 282: 61-67. DOI:10.1016/j.jhazmat.2014.06.010 (0)
[23]
LIU M, ZHANG Y, YANG M, et al. Abundance and distribution of tetracycline resistance genes and mobile elements in an oxytetracycline production wastewater treatment system[J]. Environmental Science & Technology, 2012, 46(14): 7551-7557. (0)
[24]
DUAN M, LI H, GU J, et al. Effects of biochar on reducing the abundance of oxytetracycline, antibiotic resistance genes, and human pathogenic bacteria in soil and lettuce[J]. Environment Pollution, 2017, 224: 787-795. DOI:10.1016/j.envpol.2017.01.021 (0)
[25]
UDIKOVIC K N, WICHMANN F, BRODERICK N A, et al. Bloom of resident antibiotic-resistant bacteria in soil following manure fertilization[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111(42): 15202-15207. DOI:10.1073/pnas.1409836111 (0)
[26]
曹云, 常志州, 黄红英, 等. 畜禽粪便堆肥前期理化及微生物性状研究[J]. 农业环境科学学报, 2015, 34(11): 2198-2207.
CAO Yun, CHANG Zhizhou, HUANG Hongying, et al. Chemical and biological changes during early stage of composting of different animal wastes[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2015, 34(11): 2198-2207. DOI:10.11654/jaes.2015.11.023 (0)
[27]
AWASTHI S K, WONG J W C, LI J, et al. Evaluation of microbial dynamics during post-consumption food waste composting[J]. Bioresource Technology, 2018, 251: 181-188. DOI:10.1016/j.biortech.2017.12.040 (0)
[28]
ZHANG L, GU J, WANG X, et al. Behavior of antibiotic resistance genes during co-composting of swine manure with Chinese medicinal herbal residues[J]. Bioresource Technology, 2017, 244: 252-260. DOI:10.1016/j.biortech.2017.07.035 (0)
[29]
QIAN X, SUN W, GU J, et al. Variable effects of oxytetracycline on antibiotic resistance gene abundance and the bacterial community during aerobic composting of cow manure[J]. Journal of Hazardous Materials, 2016, 315: 61-69. DOI:10.1016/j.jhazmat.2016.05.002 (0)
[30]
FANG H, WANG H, CAIET L, et al. Prevalence of antibiotic resistance genes and bacterial pathogens in long-term manured greenhouse soils as revealed by metagenomic survey[J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(2): 1095-104. (0)
[31]
US EPA. Environmental regulations and terminology:control of pathogens and vector attraction in sewage sludge[J]. US Environmental Protection Agency Office of Research & Development, 1999, 107(47): 20465-20470. DOI:10.1073/pnas.1010990107 (0)
[32]
SOOBHAY N. Preliminary evaluation of pathogenic bacteria loading on organic municipal solid waste compost and vermicompost[J]. Journal of Environmental Management, 2018, 206: 763-767. DOI:10.1016/j.jenvman.2017.11.029 (0)
[33]
POURCHER A M, MORAND P, PICARD B F, et al. Decrease of enteric micro-organisms from rural sewage sludge during their composting in straw mixture[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(3): 528-539. (0)
[34]
HUERTA B, MARTI E, GROST M, et al. Exploring the links between antibiotic occurrence, antibiotic resistance, and bacterial communities in water supply reservoirs[J]. Science of the Total Environment, 2013, 456/457: 161-170. DOI:10.1016/j.scitotenv.2013.03.071 (0)
[35]
YANG Y, LI B, JU F, et al. Exploring variation of antibiotic resistance genes in activated sludge over a four-year period through a metagenomic approach[J]. Environmental Science & Technology, 2013, 47(18): 10197-10205. (0)
[36]
ZHANG Y, YANG Z, XIANG Y, et al. Evolutions of antibiotic resistance genes (ARGs), class 1 integron-integrase (intl1) and potential hosts of ARGs during sludge anaerobic digestion with the iron nanoparticles addition[J]. Science of the Total Environment, 2020. DOI:10.1016/j.scitotenv.2020.138248 (0)
[37]
JECHALKE S, SCHREITER S, WOLTERS B, et al. Widespread dissemination of class 1 integron components in soils and related ecosystems as revealed by cultivation-independent analysis[J]. Frontiers in Microbiology, 2014, 4: 1-8. (0)